揭秘“DNA分子逻辑门”

分子运算是实现DNA计算机的关键。在传统的电子计算机设计中，微处理器应用基本遇辑门(与、或、非等)构建能够执行布尔数学逻辑的电子电路。与此类似，在分子运算中一个主要的目标就是设计出可寻址的分子逻辑门。目前，在基于电子学的分子计算机中，人们可以应用无机或有机材料构建纳米级的电子逻辑门；在基于化学的电子计算机中，也有方法应用分子或超分子系统构建光学逻辑门。这些逻辑门具有共同的输入输出信号(电子和光)，因而较易实现逻辑门之间的连接，从而可以构造分子电路。而逻辑门之间的连接在基于DNA的生物计算机中则是一个相对较难的问题。下面将对基于DNA分子的逻辑门设计、逻辑门之间的连接进行介绍。

一、DNA逻辑门的物质基础

DNA(脱氧核糖核酸)是生物遗传的物质基础。DNA由四种碱基(A、T、G和C)组合而成，并通过碱基的排列组合存储生物遗传信息。DNA的一个重要特性是DNA链可以通过碱基互补配对作用形成杂合的双链双螺旋结构，而且配对具有高度的特异性，即A只能与T，G只能与C结合。这种特异性作用是DNA可用于构建逻辑门的基础之一。

与DNA不同，在生物体内RNA(核糖核酸)是以单链形式存在的，而且往往通过链内的碱基配对形成一定的三维结构，并发挥特定的生理功能。与此类似，除了DNA双链结构可以用于DNA逻辑门的构建以外，特定的核酸结构也是非常有用的构造元件。核酶(Ribozyme)和核酸配体(Aptarner)是现在受到广泛关注的核酸结构，它们可为DNA，也可以为RNA，或者DNA和RNA的杂合体。核酶是80年代初期发现的具有催化功能的核酸分子，具有高度专一内切核酸酶的活性。与常见的蛋白质组成的酶相似，核酶能加速细胞内的化学反应。经过科学家十多年的研究，核酶已发展成为一项广泛应用于健康和疾病预防中的新型技术，显示出了广阔的应用前景。核酸配体则是完全由人工体外筛选产生的概念。受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，Gold等于1990年构建了随机核酸库并从中筛选出与靶蛋白特异结合的核酸配体，这种方法被命名为SELEX技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment指数富集的配体系统进化)。其基本原理就是利用分子生物学技术构建人工合成的约20-40bp单链随机寡核苷酸文库，其容量在1014-1015之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物，甚至金属离子结合，形成具有特异性识别作用的复合物。利用这一原理，将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶分子相互作用，洗脱筛选出特异的核酸配体，经RT-PCR及体外转录生成新的次一级文库，再与靶物质结合。反复数个循环，即可筛选出能与靶物质特异结合的寡核苷酸片段。理论上，利用SELEX技术人们可以筛选出针对任意靶物质的配体，并应用于临床治疗和诊断等领域。目前核酶已经被广泛应用到DNA逻辑门的研制中，而核酸配体的应用还未见报道，然而可以预期随着研究的深入，由于核酸配体的多样性和复杂性，可能在DNA逻辑门研究中发挥越来越重要的作用。

二、基于DNA分子杂交过程的逻辑门

美国Scripps研究所的Ghadiri等在2003年提出了通过荧光标记的DNA分子构建分子逻辑门的方法。利用DNA分子之间的配对作用和多种荧光分子之间Foster共振能量转移(FRET，Foster resonaqce energy transfer)效应，他们构建了三种光学逻辑门：AND，NAND和INHIBIT。

AND门的基本元件是一个3’端标记有荧光素的16碱基的DNA片断1；输入1是一段与之完全互补配对的16碱基DNA 2；输入2是一种可以与DNA双链的小沟结合的荧光染料Hoechst 33342。Hoechst 33342可在350 nm被激发，在约450 nm处发出荧光，因此可以与在490 nm处被激发的荧光素发生很好的FRET，从而激发荧光素发出520 nm的荧光。输出被定义为在350 nm激发时520 nm处的荧光强度。因此在输入1和输入2均不存在时，由于只有荧光素存在且不能被350 nm的光激发，输出为0；在仅有输入1存在时，仍然不存在Hoechst 33342，输出也为0；在仅有输入2存在时，由于DNA是单链，而Hoechst 33342只能与双链结合，所以DNA上标记的荧光素与Hoechst 33342之间也不能发生很好的FRET，输出仍为0；只有当输入1和输入2都存在时，DNA片断1和片断2发生配对形成双链，Hoeehst 33342与双链的小沟区域结合，因而靠近片断1上标记的荧光素，可以通过FRET激发荧光素的荧光，使之发出520 nm的荧光，产生输出1。由此可以看出，这种组合方式完全符合“与门”AND的条件，即当且仅当两个输入都存在时输出才为1。

NAND是与门与非门的结合，在电子逻辑门中，AND门的输出被送到一个反转器，使所有的0输出变成1，1输出变成0。Ghadiri等设计的NAND门是将AND门中的输入2从Hoechst 33342改为溴乙啶(EB)，并将输出从350 nm激发改为适合荧光素激发的490 DITI。EB是一种DNA插入剂，且在插入状态可以猝灭荧光素的荧光。因此，在输入l(互补链2)和2(EB)都不存在或只有输入1存在时，荧光素可以被激发并发出520 nm处的荧光，产生输出1；如果只有输入2，由于EB不能插入单链，荧光素仍然能够发出荧光，输出．1；而如果输入1和2均存在，DNA双链结构形成，使EB插人并猝灭荧光素的荧光，这时的输出就变成了O。

为了展示这种DNA逻辑门可以用来排布成逻辑电路，Ghadiri等设计了INHIBIT门，即将AND和NAND结合起来，产生一个逻辑门的输出传递到下一个逻辑门作为输入。INHIBIT门的基本元件仍然为3’端标记有荧光素的16碱基的DNA片断1；输人1为互补链2；输入2为Hoechst 33342；输入3为EB；输出为350nm激发时产生的520 nm处的荧光强度。INHIBIT定义为在输入3存在时，不管其它输入是否存在，输出值均为0。因此，在输入3EB不存在时，INHIBIT门简化为AND门，即当且仅当输入1和2存在时可以观察到520 nm处的荧光；当EB存在时，由于其荧光猝灭作用，即使输入1和2产生了荧光也可以被猝灭，因此输出永远为0。

从以上结果可以看出，基于这些简单的DNA分子杂交反应和FRET效应人们可以设计成精巧的分子逻辑门，而且逻辑门之间可以发生信号传输，因此很有希望发展成为可寻址的分子逻辑门的研究平台。然而也应该指出，目前之一研究涉及的逻辑门还比较简单，当要求多个逻辑门存在时，如何找到合适的荧光FRET对且不发生相互的重叠可能是一个较难解决的问题。这些都有待于进一步深入的研究。

三、基于核酶的逻辑门

正如前面提及的，核酶可以具有非常复杂的三维结构，而且具有特定的酶活性，因此可以构造非常精巧的分子逻辑门。Stojanovic是利用核酶构造分子逻辑门的先驱之一例5。他选用了一种具有核酸水解酶活性的DNA核酶，这种核酶具有特定的茎一环结构，可以特异性水解带有一个核糖核苷的杂合DNA片断(底物)。利用这种核酶可以很方便地构建“非门”NOT，即将核酶和两端分别带有荧光素和猝灭剂的底物作为基本元件，输入1为一段可以与核酶的“环”部分特异性结合的别构效应物(allesteric effector)，可以特异性地调控核酶的活性，使之不能发生水解作用。当输入1不存在时，核酶可以通过攻击底物的核糖核苷并将底物水解，这样就释放了荧光素使之产生荧光(输出1)；当输入1存在时，核酶的茎一环结构被别构效应所破坏，失去了水解活性，底物仍然保持完整，荧光素被猝灭剂所猝灭，不能产生荧光(输出0)。基于类似的思路，Stojanovic等构建了更为复杂的逻辑门，并且完成了半加法器(halGadder)的设计。

尽管利用核酶进行DNA逻辑门设计具有非常大的优势，但是Stojanovic使用的核酶需要将含有核糖核苷的杂合DNA作为底物。由于RNA核苷的化学稳定性差，容易自我降解，而且杂合DNA合成成本非常高，因此这种逻辑门的推广是存在问题的。最近我们设计了一种完全由DNA碱基构成的逻辑门，从而解决了这一问题。在这个工作中选用了一种铜离子依赖的DNA核酶，这是由Breaker等首先用SELEX方法发现的。基于这种核酶，可以方便地构建YES门、NOT门等基本的逻辑门。主要是通过别构效应物存在下核酶结构的变化来调控其水解酶活性，使之产生或不产生底物水解切割反应，然后用电泳方法可以鉴别水解反应是否发生。基于这一方法也可以实现逻辑门之间的连接，形成较为复杂的逻辑门，如在此工作中设计的AND(A，NOT(B)，NOT(C))。

基于核酶的逻辑门已经引起了研究者的广泛关注，然而这种逻辑门能否成为未来DNA计算机的基础还存在很多关键性问题。例如水解作用需要较长的时间(几分钟到几小时)，逻辑门之间的连接仍然存在一些问题等。前者由于DNA的超级并行计算能力可能在大规模计算时可以容忍，而后者则可能需要引入新的元件。例如最近出现的基于具有连接酶活性的核酶逻辑门。连接酶逻辑门的优势在于可以使下游逻辑门不断输出更长的DNA序列用于构建连续电路，而且连接酶可以为水解酶提供新的底物，从而得以重建电路。

基于DNA分子的逻辑门模拟了数字电子计算机的逻辑设计。在解决了基本逻辑门的连接问题之后，如果要解决更大规模的生物分子逻辑设计问题并进一步建立标准输入输出的DNA计算机，必须还要解决如何充分应用DNA计算的并行性特点的问题。

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